Citogenetica

La citogenetica si occupa dello studio dei cromosomi, della loro struttura , dei meccanismi e delle modalità con cui vengono ereditati.

Le anomalie dei cromosomi, in quanto comuni, costituiscono un importante argomento di studio: infatti un neonato su 150 è portatore di una anomalia cromosomica; inoltre vengono riscontrate anomalie cromosomiche nel 50% degli aborti spontanei del 1° trimestre e nel 2% delle gravidanze intraprese da donne che abbiano superato il 35° anno di età.

Parlando di citogenetica è importante distinguere tra anomalie cromosomiche costituzionali e acquisite. Le prime si riferiscono al corredo genetico presente alla nascita; queste anomalie sono di solito presenti in ogni cellula del corpo, sono spesso ereditate, e a rischio di essere trasmesse alla prole. Le anomalie cromosomiche acquisite si verificano invece dopo la nascita (o almeno dopo il concepimento), hanno una distribuzione tessutale limitata (per esempio sono presenti soltanto in un tumore), non vengono ereditate e non sono a rischio di essere trasmesse alla prole

ORGANIZZAZIONE CITOGENETICA DEL GENOMA UMANO

Il genoma umano è organizzato in 23 coppie di cromosomi. Ogni cromosoma è formato da un filamento continuo di DNA complessato con istoni ed altre proteine.

ANALISI E CLASSIFICAZIONE DEI CROMOSOMI

Per l’analisi dei cromosomi sono necessarie cellule in attiva proliferazione. Soltanto durante la divisione cellulare i cromosomi sono infatti visibili al microscopio ottico.

I leucociti del sangue periferico vengono spesso utilizzati per l’analisi cromosomica di routine, per la facilità di ottenimento del campione. Altri tessuti utili sono il midollo osseo (principalmente utilizzato per la diagnosi di neoplasie e displasie ematologiche), tumori solidi, la pelle (utilizzata frequentemente per diagnosticare mosaicisti cromosomici) e le cellule del liquido amniotico o dei villi coriali (nella diagnosi prenatale delle anomalie cromosomiche).

Prima della nascita delle tecniche di bandeggio il citogenetista classificava i cromosomi soltanto in base alla dimensione del cromosoma e alla posizione del centromero. L’ individuazione del singolo cromosoma non era in questo modo possibile e i cromosomi venivano classificati soltanto in gruppi.

Lo sviluppo di diverse tecniche di bandeggio a partire dai primi anni ’70 (es. Q-banding, G-banding, R-banding) ha rivoluzionato la citogenetica, rendendo possibile l’individuazione di ogni singolo cromosoma.

Il cariotipo è il risultato dell’analisi cromosomica e consiste in una fotografia o una stampa dei cromosomi di un individuo, ottenuti da una coltura cellulare, sottoposti ad una tecnica di bandeggio, e ordinati e numerati in base alla lunghezza e alla posizione del centromero.

CITOGENETICA MOLECOLARE

L’analisi cromosomica di routine permette di diagnosticare anomalie numeriche e strutturali dei cromosomi, ma soltanto se queste sono abbastanza grandi da essere osservabili al microscopio ottico con le classiche tecniche citogenetiche. Quindi piccole delezioni o traslocazioni cromosomiche e piccoli cromosomi marker sono spesso difficili se non impossibili da identificare con l’analisi cromosomica di routine.

Grazie all’introduzione della FISH (ibridazione in situ fluorescente) a partire dai primi anni ’90, si è ora in grado di eseguire contemporaneamente una analisi molecolare e citogenetica.

La FISH ha esteso il raggio di azione della citogenetica, consentendo l’identificazione di piccole delezioni, traslocazioni e altri riarrangiamenti cromosomici troppo piccoli per essere visti con le consuete tecniche di bandeggio e colorazione dei cromosomi.

La FISH è una tecnica mediante la quale una sonda colorata specifica per un dato segmento di DNA viene ibridata con i cromosomi metafasici, profasici o interfasici, e quindi visualizzata con un microscopio a fluorescenza.

ANOMALIE CROMOSOMICHE

Le anomalie cromosomiche vengono suddivise in due categorie principali: le anomalie di numero e le anomalie di struttura. Le prime si riferiscono a corredi cromosomici anomali per quel che riguarda il numero dei cromosomi; le anomalie strutturali includono i riarrangiamenti cromosomici, le delezioni e le duplicazioni.

Anomalie numeriche

Sono le aneuploidie (assenza di un cromosoma o presenza di un cromosoma in più) e le poliploidie (presenza di un corredo cromosomico che è un multiplo diverso da due del numero cromosomico aploide).

Le aneuploidie possono riguardare sia gli autosomi che i cromosomi sessuali. Le più comuni sono le monosomie (45 cromosomi) e le trisomie (47 cromosomi).

Nella maggior parte dei casi le aneuploidie sono il risultato della non-disgiunzione dei cromosomi, che si può verificare durante la gametogenesi, in 1° o 2° divisione meiotica. La maggior parte delle aneuploidie degli autosomi è il risultato della non-disgiunzione materna durante la prima divisione meiotica, evento che è stato dimostrato essere associato con l’età materna avanzata.

Anomalie strutturali

Possono essere bilanciate o sbilanciate. I riarrangiamenti bilanciati non producono perdita o esubero di materiale genetico e quindi di solito non hanno alcun effetto fenotipico. Tuttavia gli individui con un riarrangiamento bilanciato sono a rischio per la produzione i gameti sbilanciati.

Le traslocazioni riguardano lo scambio di materiale genetico tra cromosomi non omologhi.

Le traslocazioni reciproche sono causate dalla rottura di cromosomi non omologhi seguita dal reciproco scambio di materiale cromosomico.

Le traslocazioni robertsoniane sono il risultato della fusione al centromero dei bracci lunghi di due cromosomi acrocentrici.

Le inversioni derivano da due punti di rottura in un cromosoma, con inversione del segmento compreso tra i due punti e sua reinserzione nel sito originale.

Le delezioni sono causate da uno o due punti di rottura in un cromosoma, con risultante perdita di materiale genetico. Possono essere terminali o interstiziali.

Le duplicazioni consistono in una duplicazione di un semento cromosomico e risultano in una trisomia parziale.

INDICAZIONI PER L’ANALISI CROMOSOMICA

a) individui con malformazioni congenite multiple, ritardo mentale e crescita staturale insufficiente (segni tipici di anomalia cromosomica)

b) coppie con aborti ripetuti (si sospetta in questo caso che uno dei due possa avere un riarrangiamento bilanciato)

c) femmine con bassa statura e/o amenorrea primaria (possibili anomalie riguardanti il cromosoma X)

d) maschi affetti da infertilità (possibili anomalie rigudanti i cromosomi sessuali)

e) pazienti con tumori ematologici (per aiutare la diagnosi di uno specifico tipo di tumore basandosi sul tipo di anomalia cromosomica acquisita riscontrato)

f) diagnosi prenatale di anomalie cromosomiche

FISH

E’ una tecnica che unisce la genetica molecolare e la citogenetica.

DNA, tessuti, cellule o cromosomi vengono fissati su un vetrino e denaturati. Il campione viene quindi ibridato con una sonda colorata a singolo filamento e osservato al microscopio a fluorescenza.

La FISH può essere utilizzata per diagnosticare trisomie, traslocazioni e delezioni di materiale genetico troppo piccole per essere viste con i metodi citogenetici classici. Viene ad esempio comunemente utilizzata per la diagnosi delle sindromi di DiGeorge e di Prader-Willi.

Se vengono utilizzate contemporaneamente sonde per i cromosomi 21, 18, 13, X e Y è possibile effettuare con un unico test lo screening per le più comuni aneuploidie.

PCR

Permette la produzione in vitro di copie multiple di frammenti di DNA di interesse.

Con la PCR vengono utilizzate piccole quantità di DNA e il risultato è disponibile entro poche ore.

Il procedimento della PCR prevede tre stadi: denaturazione, annealing e polimerizzazione. Nella prima fase (T 95°C) il DNA viene denaturato, per essere ridotto a singolo filamento. Nell’annealing (T 50-55 °C) vengono aggiunti specifici primers per la regione di interesse. Nella terza fase (T 72°C) vengono aggiunti i nucleotidi e l’enzima polimerizzante, la Taq polimrasi, che sintetizza il doppio filamento di DNA. Il mix di reazione viene sottopoto a numerosi cicli (normalmente 30) in modo da ottenere milioni di copie del frammento (gene) di interesse.

Infine con il campione viene effettuata una migrazione elettroforetica e il gel viene colorato con bromuro di etidio per determinare la presenza o l’assenza di una banda, che rivela la presenza o l’assenza del gene patologico di interesse.