Genetica e infertilità

La Patologia della Riproduzione e la Genetica sono sempre state fortemente collegate: oggi, ancora di più rispetto al passato, questo legame risulta rafforzato in quanto i progressi scientifici degli ultimi anni hanno permesso di identificare ulteriori cause di origine genetica correlate ai problemi dell’infertilità; inoltre l’applicazione della fertilizzazione in vitro (FIVET) e della ICSI (Intracytoplasmatic sperm injection) hanno aperto ulteriori campi di interazione tra queste due discipline introducendo nuovi argomenti di discussione e nuove aree di indagine prima non praticabili.

genetica e infertilità - Promea inseminazione artificiale

Aberrazioni cromosomiche

Sin dallo studio dei primi pazienti infertili è risultato evidente che infertilità e sterilità possono essere causate da anomalie cromosomiche: aberrazioni strutturali e numeriche dei cromosomi X e Y, riarrangiamenti autosomici bilanciati in uno dei membri di una coppia hanno come conseguenza la riduzione o la perdita della fertilità e possono causare aborti spontanei precoci.

1) aberrazioni del cromosoma X

Le anomalie che si riscontrano a carico del cromosoma X sono riconducibili a tre categorie:


Aberrazioni numeriche
. Femmine 45,X (sindrome di Turner): generalmente sono sterili e frequentemente si riscontra disgenesia ovarica; i casi fertili sono solitamente mosaici 45,XX. Femmine con più di due cromosomi X (47,XXX; 48,XXXX; 49,XXXXX) generalmente hanno un fenotipo e una fertilità normali.

Maschi 47,XXY (Sindrome di Klinefelter); hanno una frequenza di 1/500 maschi e nel 10% dei casi è presente un mosaicismo. Sul piano fenotipico, i pazienti sono alti, talvolta si può osservare ginecomastia. I testicoli hanno scarse alterazioni prima della pubertà, mentre successivamente si osserva una involuzione con sclerosi, ialinizzazione dei tubuli seminiferi e soppressione della linea spermatica. Talvolta si riscontrano spermatozoi maturi nelle biopsie testicolari: si tratta in genere di soggetti con cariotipo a mosaico o pazienti con cariotipo classico con mosaicismo a basso livello confinato nelle gonadi; questo può consentire a queste persone di beneficiare dell’ICSI.


Aberrazioni strutturali.
La perdita di una parte delle braccia di un cromosoma X può essere associata a sterilità; le aberrazioni più importanti sono le seguenti: A) delezione di una parte del braccio corto (Xp-) o di una parte del braccio lungo (Xq-), B) cromosoma X ad anello (ring) in cui ci sono delezioni sia del braccio corto che del braccio lungo; questo cromosoma solitamente è presente in un cariotipo a mosaico con una linea cellulare 45,X in pazienti con sindrome di Turner ed è associato a sterilità C) isocromosoma X per il braccio lungo (Iso Xq) in cui si ha una parziale o completa duplicazione del braccio lungo o ad una perdita di quello corto. Il fenotipo è quello della sindrome di Turner e le pazienti sono sterili.

Traslocazioni. Traslocazioni reciproche bilanciate tra un cromosoma X e un autosoma (sia nella donna che nell’uomo) determinano un rischio di infertilità molto elevato se coinvolgono il braccio lungo del cromosoma X tra le bande q13 e q26; non provocano invece infertilità se coinvolgono il braccio corto. La traslocazione reciproca tra i cromosomi X (nella donna) è molto rara, solitamente è a mosaico tra con 45,X comporta disgenesia gonadica e quindi sterilità.

2) aberrazioni del cromosoma Y

Il cromosoma Y è un piccolo cromosoma acrocentrico caratterizzato da una consistente parte eterocromatica e da una piccola parte eucromatica che contiene informazione genetiche ridondanti, palindromi e cluster di geni ripetuti; all’estremità del braccio corto (Yp) e del braccio lungo (Yq) vi sono due regioni pseudoautosomiche (PAR) tramite le quali si appaia con il cromosoma X durante la meiosi.

Il cromosoma Y contiene geni e famiglie di geni che svolgono un ruolo critico nei processi di determinazione del sesso, differenziamento del testicolo e maturazione degli spermatozoi: 5 Kb a valle della regione pseudoautosomica (PAR) del braccio corto (Yp) è localizzato il gene SRY (sex-reversal-Y) che produce il “fattore di differenziazione testicolare (TDF)”, in grado di guidare lo sviluppo della gonade maschile nell’embrione; SRY appartiene alla famiglia di geni SOX (ha omologia con SOX3) molti dei quali sono implicati in processi di sviluppo durante l’embriogenesi. Il gene ZFY che per molto tempo è stato il candidato per la codificazione del TDF sembra essere invece coinvolto nella migrazione delle cellule germinali primordiali.

La mancanza o l’alterazione di questo cromosoma provoca fenotipi e manifestazioni patologiche differenti:

- maschi 45,X: è una condizione rara in cui soggetti colpiti hanno genitali maschili e testicoli differenziati; tutti i casi descritti, però, sono o mosaicismi confinati o portano materiale del cromosoma Y traslocato su un autosoma;

maschi 46,XX: è la sindrome di “reversione del sesso” più frequente nell’uomo (1/20.000 maschi); i soggetti sono maschi apparentemente normali con testicoli piccoli e azoospermia. Nella maggior parte di questi soggetti si è verificato uno scambio anomalo tra le regioni pseudoautosomiche dei cromosomi X e Y al momento della meiosi paterna; il maschio 46,XX riceve dal padre il cromosoma X con una imprevista parte del cromosoma Y recante il gene SRY . E’ interessante notare che la conseguenza degli scambi ineguali alla meiosi paterna può portare con uguale probabilità alla “femmina 46,XY” (sindrome di Swyer) dove il cromosoma Y ha perso SRY e ha acquistato parte dei geni distali del braccio corto del cromosoma X; le femmine con sindrome di Swyer hanno una disgenesia gonadica pura;

  • sindrome XYY: è presente in 1-2/1000 maschi; in genere sono maschi fertili anche se sono stati riportati casi di azoospermia;
  • Iso Yq: l’isocromosoma per il braccio lungo del cromosoma Y determina la delezione completa o parziale del braccio corto; se nella delezione è coinvolto SRY ne consegue un fenotipo femminile sterile con gonadi assenti o “streaks”;
  • Iso Yp: sono stati descritti pochi casi di isocromosoma per il braccio corto del cromosoma Y senza mosaicismo e si prevede che siano sterili
  • Y ad anello (ring): è un evento raro ed è solitamente associato ad un maschio con fenotipo normale e azoospermia
  • Yp- : piccole delezioni del braccio corto del cromosoma Y sono state descritte in alcuni casi di femmine con caratteri della sindrome di Turner in cui SRY è deleto.

Microdelezioni del cromosoma Y

A partire dall’ultimo decennio, grazie allo sviluppo delle tecniche di biologia molecolare che hanno permesso l’integrazione dei dati citogenetici con i dati delle mappe di delezione e i dati del sequenziamento del DNA, la conoscenza della struttura del cromosoma Y si è evoluta rapidamente. L’eucromatina (localizzata negli intervalli di delezione da 1 a 6) è stata stimata di 59 Mb mentre l’eterocromatina (localizzata nell’intervallo di delezione 7) risulta essere la parte preponderante di questo cromosoma; la parte eucromatica contiene almeno 30 geni diversi che possono essere suddivisi in due classi: quelli che sono specificatamente espressi nel testicolo e quelli che sono espressi ubiquitariamente e hanno degli omologhi sul cromosoma X. I geni che sono testicolo specifici tendono essere presenti in copie multiple e sono organizzati in cluster e ristretti in una data regione oppure sono dispersi lungo il cromosoma.

Studi su pazienti azoospermici e oligospermici con delezioni molto piccole in Yq (microdelezioni) hanno permesso di identificare delle regioni del cromosoma, definite AZF (azoospermia factor) la cui integrità è fondamentale per la spermatogenesi in quanto contengono dei geni implicati nella maturazione degli spermatozoi.

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La regione AZFa è localizzata in vicino al centromero, misura da 1 a 3 Mb e contiene i geni DFFRY (Drosophila development fat fet), DBY (dead box Y), UTY (ubiquitous TPR motif Y), TB4Y (Y isoform hymosin B4): l’omologo di DFFRY, DFFRX è localizzato sul cromosoma X e sfugge alla inattivazione; si pensa che questi due geni potrebbero giocare un ruolo importante nel turnover proteico prevenendo la degradazione delle proteine attraverso la rimozione dell’ubiquitina coniugata. DFFRX potrebbe essere implicato nel causare il fenotipo gonadico delle sindrome di Turner in quanto il tratto di DNA che contiene DFFRX risulta deleto in donne che presentano alcune delle manifestazioni tipiche della sindrome di Turner come la perdita massiva degli ovociti che provoca la degenerazione dell’ovario; nei maschi il ruolo di DFFRY potrebbe essere associato allo sviluppo e al mantenimento delle cellule germinali. DBY, UTY e TB4Y sono geni “house-keeping” e condividono caratteristiche simili: sono ubiquitariamente espressi e hanno degli omologhi sul cromosoma X che sfuggono alla sua inattivazione. DBY codifica una elicasi per l’RNA, UTY codifica per uno dei due epitopi dell’antigene HY mentre TB4Y codifica una isoforma Y dell’imosina B4.

La regione AZFb misura da 1 a 3 Mb e contiene: la famiglia di geni RBM (RNA binding motiv), i geni CDY (chromodomain Y), XKRA (XK-related Y), EIF1AY (eukaryotic translation initiation factor 1A) e SMCY (selected mouse cDNA of the Y). Oltre a CDY in AZFb (CDY2) esiste un secondo gene CDY (CDY1) localizzato nella regione AZFc e sembra che le due copie, entrambe attive durante la spermatogenesi, siano coinvolte nei processi di rimodellamento delle cromatina.

RBM è espresso esclusivamente nel testicolo e la proteina che codifica è stata vista nei nuclei delle cellule germinali a partire dagli spermatogoni fino agli spermatidi e si pensa che sia coinvolta nei processi si splicing; ci sono oltre 30 copie di RBM sul cromosoma Y che condividono un 85-95 % di omologia e sono classificabili in alcune sottofamiglie delle quali solo la famiglia RBM1 è attivamente trascritta.

EIF1AY e SMCY sono geni in singola copia con un omologo sul cromosoma X e sono espressi ubiquitariamente; EIF1AY codifica per una isoforma del fattore EIF necessario per la traduzione mentre SMCY (come il gene UTY) codifica per un epitopo dell’antigene HY.

La regione AZFc si estende per circa 1,5 Mb e può essere definita come il tratto che precede l’intervallo di delezione 7 (una estesa parte del cromosoma Y che contiene eterocromatina) ed è suddivisibile in sottointervalli di delezione: AZFc prossimale (AZFd), AZFc medio (contenente gran parte dei geni DAZ) e AZFc distale.

L’intera regione AZFc contiene il cluster di geni DAZ, almeno due copie dei geni PRY (PTP-BL related Y), BPY2 (basic protein Y2), TTY2 (testis transcript Y2) e copie aggiuntive di CDY e RBM; il gene BPY2 è stato rinominato VCY (variable charge Y). VCY è espresso solo nel testicolo e codifica per una piccola proteina carica positivamente dalle funzioni sconosciute; copie di questo gene sono presenti sia sul cromosoma Y che sul cromosoma X (dove prende il nome di VCX). Il gene DAZ è presente in almeno sette copie localizzate principalmente negli intervalli di delezione 5 e 6 che coprono una regione di circa 2 Mb. Nell’esone sette è contenuto il “repeat DAZ” variabile dalle 8 alle 24 copie a seconda dei geni e codifica per una proteina di 366 amminoacidi specifica per le cellule germinali; questa proteina contiene un sito di legame per l’RNA ed è in grado di legare e regolare le funzioni dell’RNA o del DNA a singolo filamento.

AZFd contiene una ripetizione invertita o palindromica e un cluster di piccole ripetizioni in tandem pentameriche (STRs) che rendono la regione estremamente instabile e delezioni di questa regione provocano un fenotipo testicolare che varia dalla sindrome SCO (Sertoly cells only) all’oligospermia associata con l’arresto spermatogenetico e che si ritrova nelle delezioni che che coinvolgono i geni RBM e DAZ; si è infatti ipotizzato che anche in AZFd siano presenti delle copie di questi geni.

Ereditabilità delle microdelezioni del cromosoma Y

Per l’analisi delle microdelezioni del cromosoma Y viene usato il DNA estratto da sangue periferico in quanto è stato dimostrato che, in individui infertili, le delezioni del cromosoma Y che si evidenziano negli spermatozoi sono le stesse che si ritrovano nelle cellule del sangue. E’ stato inoltre osservato in una popolazione di maschi infertili diventati padri per mezzo dell’applicazione della ICSI che le microdelezioni del cromosoma Y sono le medesime nelle cellule del sangue, negli spermatozoi e nelle cellule del sangue dei figli. In alcuni casi sono state invece osservate delle microdelezioni del cromosoma Y in figli di persone in cui non era stata vista alcuna alterazione. Questi risultati suggeriscono che le microdelezioni sono ereditabili oppure possono essere generate tramite due modalità: 1) mutazioni de novo nella linea germinale del padre fertile o del paziente infertile 2) errore mitotico de novo negli stadi precoci dell’embriogenesi del paziente infertile.

Nella seconda ipotesi gli individui sono dei mosaici che hanno il cromosoma Y deleto in alcune popolazioni di cellule e integro in altre; nei casi in cui c’è mosaicismo nelle cellele germinali (mosaicismo germinale) gli spermatozoi che vengono prodotti non sono tutti uguali in quanto possono avere l’unico cromosoma Y sia integro che con delle microdelezioni.

La previsione di malattie ed il rischio di trasmissione alla prole risultano molto incerte nei casi di mosaicismo.

Mutazioni nel gene responsabile della Fibrosi Cistica

La Fibrosi Cistica è una patologia autosomica recessiva che colpisce un individuo su 2500 mentre i portatori (eterozigoti) sono 1 su 25. La principale manifestazione clinica è rappresentata da una patologia polmonare: le secrezioni dense nel sistema broncopolmonare provocano ostruzione delle vie aeree, una elevata predisposizione alle infezioni, ostruzioni bronchiali e fibrosi polmonaria; le infezioni broncopolmonari sono la principale causa di morte. Nell’85% degli individui si riscontrano secrezioni pancreatiche molto dense e non sufficientemente alcaline che provocano ostruzione dei dotti e riduzione degli enzimi digestivi; la combinazione di questi effetti provoca la fibrosi pancreatica a carico sia del pancreas esocrino che di quello endocrino.

Il gene responsabile della Fibrosi Cistica, CF (Cystic Fibrosis) è localizzato in 7q31, si estende per oltre 250 Kb, contiene 27 esoni e codifica per una proteina di trasporto di 168 Kd chiamata CFTR (Cystic Fybrosis Transmembrane Conductance Regulator); CFTR si trova nella membrana apicale delle cellule epiteliali secretorie e funziona come un canale del cloro. Quando CFTR è assente o alterato gli ioni cloro non possono uscire dalla cellula e di conseguenza gli ioni sodio e l’acqua sono richiamati dal dotto secretorio dentro il citoplasma; il secreto che viene prodotto risulta molto denso in quanto è fortemente deidratato.

Un importante test diagnostico per l’identificazione di soggetti affetti da Fibrosi Cistica è la misura delle concentrazioni di sodio e cloro nel sudore in quanto questi ioni hanno una concentrazione maggiore rispetto agli individui sani; la conferma della diagnosi viene fatta mediante l’analisi del DNA.

Fino ad oggi sono state individuate più di 800 mutazioni del gene CF. La prima ad essere stata identificata è la ΔF508 (un delezione di tre paia di basi nell’esone 10 che provoca la mancanza dell’aminoacido fenilalanina in posizione 508 della sequenza proteica); questa mutazione è anche la più frequente in quanto si ritrova nel 70-75% degli alleli mutati nelle popolazioni dell’Europa centrale. Anche se esiste una considerevole eterogeneità allelica circa il 70% dei pazienti sono omozigoti o eterozigoti composti per un numero limitato di mutazioni (DF508, G542X, R553X, W1282X, N1303X, 621+1 G-T, 1717-1 G-A, 2789+5 G®A, 711+5 G®A, R347P, R1162X, 2183 AA®G); molte delle rimanenti mutazioni si trovano raramente e di solito in particolari famiglie.

Circa l’1% dell’infertilità maschile è dovuta all’ “assenza bilaterale congenita dei vasi deferenti (CBAVD) causata nell’80% dei casi dalle alterazioni della proteina CFTR; la maggior parte (98%) dei maschi con Fibrosi Cistica sono infatti sterili, in seguito ad una azoospermia ostruttiva dovuta ad anomalie delle strutture derivate dai dotti di Wolff (corpo e coda dell’epididimo, vasi deferenti e vascicole seminali), anomalie simili a quelle descritte nei pazienti con CBAVD.

Sebbene gli uomini con CBAVD non siano affetti da Fibrosi Cistica circa il 70% presenta segni sub-clinici tipici di questa patologia come test al sudore elevato, ostruzione nasale ed infezioni respiratorie ricorrenti.

Un quarto degli uomini affetti da CBAVD sono eterozigoti composti per le mutazioni del gene CF, circa la metà hanno una sola mutazione mentre nei rimanenti non è stata identificata alcuna mutazione tra quelle note. Il 25% dei pazienti ha una variante del sito accettore di splicing dell’esone 8; in questo sito si trova un tratto polipirimidinico caratterizzato 5, 7 o 9 timine (5T, 7T o 9T). La lunghezza di questo tratto modifica l’efficienza dello splicing dell’esone 9 senza il quale la proteina CFTR non è funzionante; il 9T è la variante più efficiente (95% di mRNA). Il 7T ha una efficienza del 50-70% e la variante 5T un’efficienza dell’8-10% nel produrre un mRNA integro; questa variante 5T è quella associata alla CBAVD.

Le mutazioni identificate nel gene CF possono essere distinte in due classi:

  • mutazioni comunemente presenti nei pazienti con Fibrosi Cistica e generalmente rappresentate da mutazioni cosiddette “severe” cioé associate con insufficienza pancreatica. Queste mutazioni impediscono la espressione del canale del cloro sulla membrana.
  • le mutazioni nella seconda classe alterano degli aminoacidi conservati oppure sono presenti in regioni della proteina CFTR meno critiche per la funzione del canale del cloro.

Nei pazienti con CBAVD sono presenti due mutazioni della seconda classe oppure una mutazione della prima ed una della seconda classe.

I pazienti con CBAVD hanno una spermatogenesi normalmente conservata e la tecnica ICSI ha reso possibile la procreazione; tuttavia nelle coppie nelle quali il maschio ha la CBAVD con mutazioni del gene CF vi è un rischio aumentato di avere figli con Fibrosi Cistica che è dovuto alla possibilità che la moglie sia portatrice di una mutazione nello stesso gene.

Poiché la frequenza dei portatori (eterozigoti) della Fibrosi Cistica è elevata (1/25) è importante ricercare le mutazioni più frequenti nei coniugi dei pazienti con CBAVD e nei figli che potranno nascere. In considerazione comunque del rischio di Fibrosi Cistica nella popolazione è consigliata la ricerca di mutazioni del gene CF in tutte le coppie che si sottopongono a tecniche di procreazione assistita.