Diagnosi rapida delle cromosomopatie fetali mediante QF-PCR

La Quantitative Fluorescent Polymerase Chain Reaction (QF-PCR) è una tecnica di biologia molecolare applicata con successo alla diagnosi prenatale che portato ad una vera e propria rivoluzione nel campo diagnostico. Il fattore più importante, rispetto alle tecniche tradizionali, è legato alla possibilità di eseguire test di laboratorio precisi, affidabili e soprattutto rapidi partendo da una minima quantità di materiale, a volte anche da poche cellule come ad esempio avviene nella diagnosi prenatale preimpianto in seguito a fecondazione assistita.

La metodica è stata messa a punto, agli inizi degli anni 90, un gruppo di ricercatori dell’University College of London diretti da un italiano, il prof. Matteo ADINOLFI. Attualmente in diversi paesi europei: Spagna, Austria, Germania, Francia e naturalmente Inghilterra ed Italia, il consenso per l’applicazione di tale indagine ai fini di una diagnosi rapida e sicura delle più importanti aneuploidie fetali, è in netto aumento.

A livello fetale le più importanti aneuploidie (95-98% del totale) interessano i cromosomi 21, 18, 13, X ed Y. I primi tre possono dare origine ad un corredo cromosomico soprannumerario che va sotto il nome di trisomia. Tali patologie vengono definite comunemente sindromi ed in particolare la trisomia del cromosoma 21 è denominata sindrome di Down, quella del 18 sindrome di Edwards e quella del 13 sindrome di Patau.

Per quanto riguarda i cromosomi sessuali, X ed Y, la situazione è diversa. Infatti in questi casi l’aberrazione non è una vera e propria trisomia bensì la perdita o l’aggiunta di uno dei due cromosomi rispetto all’assetto normale XX che caratterizza il sesso femminile od XY proprio di quello maschile. Si vengono così a formare assetti cromosomici atipici ad esempio la monosomia del cromosoma X denominata sindrome di Turner, XXY sindrome di Klinefelter, XXX ed XYY.

Tra le aneuploidie sopra descritte, le trisomie 21, 18 e 13 sono senz’altro quelle maggiormente responsabili di malformazioni fetali che portano a gran parte degli aborti precoci ossia durante il primo trimestre di gravidanza. In alcuni casi le gravidanze con feti affetti da trisomia 21 possono procedere nel corso dell’età gestazionale e portare alla nascita di neonati affetti da sindrome di Down.

Per i tre cromosomi autosomici l’epidemiologia risulta la seguente:

E’ ormai noto che il rischio di concepire un embrione affetto da una delle sindromi sopra elencate dipende dall’età dei genitori ed in massima parte da quella della madre. In particolare per la sindrome di Down si calcola che oltre i 40 anni una gravidanza su 100 sia interessata da questo tipo di anomalia. Tale fenomeno ha avuto, in questi ultimi anni, un impatto non indifferente a livello etico – sociale in quanto l’età media al primo parto è aumentata in maniera considerevole. Si pensi infatti che nell’ultimo trentennio, si è passati dai 20-21 anni ai 29-30 attuali. Il fenomeno, chiaramente legato a questioni di cultura e stili di vita, ha radicalmente cambiato l’approccio ad intraprendere e soprattutto a seguire nel tempo un evento considerato fisiologico quale la gestazione.

Al fine di ridurre tali tempi di attesa che per una donna in gravidanza costituiscono oggetto di ansietà e stress non indifferente, un gruppo di genetisti inglesi ha messo a punto una tecnica che permette di definire lo stato dei cromosomi 21, 18, 13, X ed Y.

La tecnica QF-PCR si basa sull’amplificazione genica abbinata alla possibilità di riconoscere anche minime variazioni del DNA contenuto nel campione sottoposto all’indagine. Questo metodo applicato alle cellule del liquido amniotico, villi coriali e sangue fetale permette di definire l’esatto assetto del DNA dei cromosomi presi in considerazione.

La tecnica prevede un’estrazione di DNA a partire da materiale di origine fetale. Per quanto riguarda il liquido amniotico si parte da piccole quantità, normalmente 2-3 ml mentre per un prelievo da villocentesi sono sufficienti 1-2 villi.

Unica particolarità importante è che il campione deve essere il più possibile privo di contaminazione da materiale materno (sangue o decidua).

Il DNA estratto per semplice bollitura viene sottoposto ad amplificazione genica a cicli controllati utilizzando inneschi derivati da sequenze microsatellitari (le stesse che vengono utilizzati per le indagini di tipo forense) specifiche per i cromosomi 21, 18, 13, X ed Y. In particolare vengono utilizzati i seguenti microsatelliti cromosoma specifici denominati STR (Short Tandem Repeat): D21S1411 (21q22.3), D21S1412 (21q22.2) e D21S1414 (21q21) per il cromosoma 21, D18S386 (18q22.1) e D18S535 (18q12.2) per il 18, D13S631 (13q31-32) per il 13, AMXY (X/Y), HPRT (Xq26.1) per i cromosomi sessuali.

Gli amplificati ottenuti vengono rivelati mediante elettroforesi capillare.

La letteratura internazionale offre al momento attuale circa 50.000 indagini prenatali consecutive eseguite tramite QF-PCR delle quali 20.000 circa in Italia. La sensibilità della metodica nei confronti dei 5 cromosomi presi in considerazione è risultata del 100% ossia: non si sono riscontrati né falsi negativi né falsi positivi.

Il metodo risulta sensibile nella diagnosi delle trisomie 21, 18 e 13 sia libere che da traslocazione senza però poter distinguere le due forme. Permette inoltre la diagnosi delle forme cosiddette criptiche o pseudotrisomie. I mosaicismi vengono evidenziati solo nel caso in cui siano superiori al 30%. Infine grazie all’utilizzo di 5 microsatelliti esiste un’ottima correlazione rispetto le tecniche citogenetiche tradizionali per quanto concerne le aneuploidie dei cromosomi X ed Y.

La tecnica della QF-PCR presenta le seguenti particolarità:

• Fornisce, nell’arco delle 3-12 ore, dati relativi alle aneuploidie 21, 18, 13, X, Y perfettamente correlate con quelle evidenziabili tramite coltura cellulare. Quest’ultima ha tempi di refertazione tra i 15-20 giorni.
• Necessita di minime quantità di materiale: 2-3 ml di liquido amniotico, 1-2 villi coriali o 0,3 ml di sangue. La tecnica e’ stata recentemente applicata con successo su cellule celomatiche (o villi primitivi) prelevate mediante lavaggio cervicale a partire dalla 5^ settimana di gestazione. Essa trova applicazione anche per la diagnosi di malattie monogeniche come: fibrosi cistica, talassemie, distrofia muscolare, ecc
• Possibilità di eseguire indagini prenatali dalla 10° alla 34° settimana di gestazione.

Le ricadute pratiche di questo esame sono:

• Abbattimento totale dell’ansieta’ materna (entro 24-48 ore dal prelievo invasivo) dovuta all’aumento di rischio di cromosomopatie fetali come avviene, ad esempio, per i falsi positivi del tritest, test combinato, test integrato, ecc
• Possibilita’ di procedere, da parte del ginecologo, ad un eventuale azione terapeutica con 1 mese di anticipo, rispetto ad un risultato ottenuto con le tecniche tradizionali; questo a tutto vantaggio della qualita’ di vita della gravida oltre ad un notevole riduzione della degenza.