La coltura embrionaria
Dal momento in cui si uniscono ovocita e spermatozoo (formazione dello zigote) inizia la coltura embrionaria. I fenomeni biologici che portano alla formazione di un embrione sono innumerevoli ma soprattutto estremamente delicati e complessi. Per riprodurre in vitro le condizioni fisico-chimiche che caratterizzano l’utero materno sono necessarie esperienza e una sofisticata tecnologia.
La coltura serve a monitorare la crescita degli embrioni (la morfocinetica) in modo da selezionare quelli evolutivi ovvero con potenzialità maggiore di dare una gravidanza e prescinde dal fatto che si esegua il trasferimento in utero a fresco oppure con embrioni scongelati.
La coltura embrionaria può quindi concludersi in fasi differenti che possono andare dal giorno 2 o 3 fino al giorno 5 – 6 – 7. Il momento migliore per eseguire il transfer o per procedere al congelamento dipende dalle caratteristiche morfocinetiche degli embrioni, dall’anamnesi di coppia e dalle indicazioni del ginecologo.
(foto zigote/3PN e embrioni due/quattro/otto cellule)
Scala di valutazione morfologica degli embrioni:
| CLASSIFICAZIONE EMBRIONI | DESCRIZIONE |
| 1° numero | Numero di blastomeri |
| 2° numero | grado di frammentazione [da 0 a 4] (*) |
| 3° numero | grado di simmetria [da 1 a 3] (*) |
(*) a numero decrescente corrisponde una migliore qualità
Nel nostro Centro per gli embrioni, viene utilizzata una delle classificazioni approvate dal Consensous di Istambul del 2011 (Ref. Scott. Hum. Reprod. 15(11):2394-2403.2000) e consiste nella valutazione di tre parametri: NUMERO DI BLASTOMERI, GRADO DI FRAMMENTAZIONE e SIMMETRIA. Ad ogni embrione verrà quindi assegnata una valutazione composta da un numero a tre cifre, ad esempio 801.
Esempi di classificazione:
Ad esempio con 2 0 1 si può descrivere la seguente situazione:
- 2 perché l’embrione al momento della valutazione ha 2 cellule (blastomeri)
- 0 perché non si presentano frammenti
- 1 perché le cellule sono simmetriche (hanno lo stesso volume)
oppure con 8 0 1 si descrive la seguente situazione:
- 8 perché l’embrione al momento della valutazione ha 8 cellule (blastomeri)
- 0 perché non si presentano frammenti
- 1 perché le cellule sono simmetriche (hanno lo stesso volume)
Coltura embrionaria allo stadio di blastocisti:
La gravidanza si instaura nel momento in cui la blastocisti attecchisce a livello dell’endometrio uterino dopo essersi liberata del guscio proteico (zona pellucida) derivante dall’ovocita (Hatching).
A partire dalla fine della terza giornata, l’embrione comincia a subire una profonda trasformazione della propria struttura. Le cellule che lo compongono, chiamate blastomeri, iniziano ad interagire tra di loro formando dei canali che permettono loro di avvicinarsi e compattarsi formando la morula. La compattazione e’ un evento fondamentale per questa trasformazione e precede la blastulazione. All’interno della morula, tra la quinta e la settima giornata, comincia a formarsi uno spazio composto di liquido che mano a mano si espande (blastocele) e spinge le cellule verso l’esterno, a contatto con zona pellucida. Si forma quindi la blastocisti, costituita da una parete di cellule appiattite (il trofoectoderma, da cui si formeranno gli annessi embrionali) e da un gruppo di cellule (la massa cellulare interna, dalle quali si formerà il bottone embrionario). L’achitettura dell’embrione a questo punto è completamente cambiata. I fenomeni che portano a questa trasformazione sono molti, complessi ed estremamente delicati. Superare questa serie di ostacoli rappresenta da un certo punto di vista una conferma della competenza dell’embrione, poiché’ statisticamente, sia in vivo che in vitro, non tutti gli embrioni riescono a raggiungere questo stadio di sviluppo.
Quindi, date queste premesse, possiamo dire che i vantaggi della coltura a blastocisti sono:
- una migliore selezione degli embrioni, distinguendo quelli evolutivi e potenzialmente competenti
- un aumento della percentuale di impianto
- una ottimizzazione del numero di transferimenti embrionali
- una migliore sincronizzazione tra lo sviluppo embrionale e l’ambiente uterino, (l’embrione giunge fisiologicamente nella cavità uterina uscendo dalla tuba in questa fase di sviluppo embrionale).
Tuttavia bisogna tener conto che la selezione embrionaria potrebbe concludersi in un mancato trasferimento a causa della non evolutività allo stadio di blastocisti di tutti gli embrioni in coltura.
Incubatori e tecnologia timelapse:
Dagli albori della Procreazione Medicalmente Assistita la tecnologia su cui ci si appoggia ha fatto passi da gigante. Dopo molti anni di ricerca siamo a conoscenza di un vasto carico di nozioni che oggi permettono di ottimizzare e rendere più sicure le colture cellulari.
Il nostro centro possiede l’ultima generazione di incubatori studiati esclusivamente per la Procreazione medicalmente assistita.
In particolare eseguiamo anche colture embrionarie con la tecnologia Time Lapse.
Scala di valutazione morfologica delle blastocisti:
Nel nostro Centro per le blastocisti viene utilizzato il sistema di valutazione di Gardner
La blastocisti viene classificata combinando la valutazione di tre parametri morfologici: la GRANDEZZA ED ESPANSIONE, la MASSA CELLULARE INTERNA e infine il TROFOECTODERMA. Ad ogni blastocisti verra’ quindi assegnata una valutazione composta da un numero e due lettere ad esempio 6AA.
- GRANDEZZA ED ESPANSIONE:
| CLASSIFICAZIONE | DESCRIZIONE |
| 1 | Blastocisti precoce: il blastocele e’ grande circa meno della metà del volume dell’intera blastocisti. |
| 2 | Blastocisti: il blastocele si presenta piu’ grande oppure uguale alla meta’ del volume della blasocisti. |
| 3 | Blastocisti standard: il blastocele e’ ben rappresentato |
| 4 | Blastocisti espansa: la zona pellucida e’ visivamente assottigliata a causa dell’aumento del volume della blastocisti. |
| 5 | Blastocisti in Hatching: il trofoectoderma comincia ad erniare attraverso la zona pellucida. |
| 6 | Blastocisti completamente in hatching: la blastocisti in seguito alla rottura della zona pellucida e’ completamente fuoriuscita. |
- MASSA CELLULARE INTERNA:
| CLASSIFICAZIONE | DESCRIZIONE |
| A | Numerose cellule addensate tra loro |
| B | Alcune cellule raggruppate con minore densità |
| C | Poche cellule, non si distingue in maniera netta la massa cellulare interna |
- TROFOECTODERMA:
| CLASSIFICAZIONE | DESCRIZIONE |
| A | Molte cellule che formano un epitelio molto ben organizzato e monostratificato |
| B | Epiteio con una densità cellulare inferiore |
| C | Epitelio formato da poche cellule non ancora ben organizzate |
La combinazione di questi tre parametri permette di descrivere un largo ventaglio di sfumature che si possono presentare a livello morfologico.
Esempi di classificazione:
Ad esempio con 5AB si può’ descrivere la seguente situazione:
- 5 perché come si osserva ad ore 02:00 si sta verificando l’hatching. Ovvero il trofoectoderma sta cominciando ad erniare attraverso la zona pellucida
- A perché la massa cellulare interna (ad ore 03:00) e’ ben rappresentata, formata da molte cellule addensate tra loro
- B perché il trofoectoderma non e’ perfettamente organizzato
oppure con 4AA si descrive la seguente situazione:
- 4 perché la zona pellucida e’ visivamente assottigliata ma non e’ ancora in Hatching
- A perché la massa cellulare interna (ad ore 07:00) e’ ben rappresentata, formata da molte cellule addensate tra loro
- A perché il trofoectoderma e’ ben organizzato e monostratificato
(Tutte le immagini del sito sono originali e sono state acquisite per mezzo della strumentazione del laboratorio Promea s.r.l. e non possono essere divulgate per altri scopi)
Documenti di riferimento
Consenso informato alla prosecuzione della coltura embrionaria allo stadio di blastocisti (MOD-41-MPO-LAB)
IL Singolo Embrio Transfer
| Numero di Blastocisti | Ovociti donati | <35 aa | 35-37 aa | 38-40 aa | 41-42 aa | >42 aa |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 1-3 | 58% | 61% | 51% | 39 % | 22% | 13% |
| 4-6 | 62% | 60% | 52% | 38% | 23% | 17% |
| 7-10 | 65% | 62% | 51% | 36% | 21% | 14% |
| >10 | 68% | 55% | 55% | 37% | 25% | n/a |
Il numero di embrioni euploidi diminuisce in ART si riduce significativamente con l’aumentare dell’età materna
Casistica blastocisti a fresco – Promea 2014- 2015
| totale | 1 Blastocisti | 2 Blastocisti | 3 Blastocisti | |
|---|---|---|---|---|
| N° pazienti | 214 | 22 | 180 | 12 |
| Età media | 36,47 (26-45) | 36,17 | 36,36 | 38,67 |
| N° di ovociti inseminati | 9,3 (4-17) | 9,26 | 9,15 | 12,08 |
| % fecondazione | 82 | 82 | 83 | 79 |
| % blastulazione | 53 | 44,19 | 55,52 | 41,44 |
| N° medio di blastocisti trasferite | 1,95 (1-3) | 1 | 2 | 3 |
| Gravidanza clinica | 42, 33% (91/214) | 30,43 %(7/22) | 45,56%(82/180) | 16,67% (2/12) |
| Implantation rate | 27,21% (114/419) | 30,33 %(7/22) | 29,17% (105/360) | 5,56%(2/36) |
| Aborto | 27,5%(25/91) | 14,28%(1/7) | 28,05%(63/180) | 0% |
| Parti | 33,49% (72/214) | 26,9% (6/22) | 35% (63/180) | 16,67% (2/12) |
| Parti gemellari | 22,5% (16/72) | 0 % | 25,4% (16/63) | 0% |
| < 35 aa | 35-39 | = 40 | |
|---|---|---|---|
| N° pazienti | 69 | 89 | 56 |
| Età media | 31,77 | 36,9 | 41,59 |
| Gravidanza clinica | 47,83% (33/69) | 44,95%(40/89) | 30,36%(17/56) |
| Implantation rate | 32,82%(43/131) | 30,29%(53/175) | 15,32%(17/111) |
| Aborto | 21,2% (7/33) | 25%(10/40) | 47,06%(8/17) |
| Parto | 40,58%(28/69) | 35,96(32/89) | 17,86%(10/56) |
| Gemelli | 25% (7/28) | 28%(9/32) | 0% |
Un video per concludere